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RNA-FISH-单细胞基因表达检测

ViewRNA 是一种新型 RNA原位杂交技术,融合了传统RNA原位杂交技术与FISH技术的优点。基于专利保护的双“ZZ”探针组设计方案与专有的信号放大方法,在准确性、灵敏度、重复性等方面都大幅提高,可以在单细胞中对多个目标基因的低拷贝乃至单拷贝RNA做出检测。整个实验流程与FISH相似,但时间大大缩短。

一.概述

1. RNA原位核酸杂交

RNA原位核酸杂交(RNA nucleic acid hybridization in situ)又称RNA原位杂交组织化学(RNA in situ hybridization histochemistry)或RNA原位杂交(RNA in situ hybridization RISH)。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是:在细胞或组织结构保持不变的条件下,用标记的已知的RNA核苷酸片段,按核酸杂交中碱基配对原则,与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交),所形成的杂交体经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。

RNA原位杂交技术经不断改进,其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析,已成为最有效的分子病理学技术,同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一个重要方向。

RNA原位杂交不同于DNA原位杂交,主要有:

(1)检测目的不同:RNA原位杂交检测和分析的主要为内源性基因,包括细胞内固有基因、异常基因和变异基因。以正确反映组织与细胞之间相互关系及功能、代谢状态、探索疾病发病机理、观察治疗疗效和评估疾病预后等。其次是对外源性基因检测,以获得病毒和细菌类型等病原学诊断。而DNA原位杂交主要是在DNA水平检测外源性基因或异常基因。

(2)有较高的灵敏度:在检出细胞和组织内低拷贝核苷酸时,RNA原位杂交能获得较好定位,而DNA原位杂交则难以信任。

(3)使用的探针不同:RNA原位杂交中多采用RNA或寡核苷酸探针,因此避免了应用双链DNA探针在杂交反应中存在的两条链之间的复性和第二条链的竞争性杂交问题。cRNA-RNA之间形成的杂交体要比DNA-DNA、cDNA-RNA杂交体性能稳定,在杂交反应后可用RNA酶洗脱,以除去未结合的探针,因此特异性更强。

2.荧光原位杂交

荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization FISH)是一门新兴的分子细胞遗传学技术,是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。

与传统的放射性标记原位杂交相比,荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点,因此在生物、药物研究领域受到普遍关注。

3.ViewRNA

ViewRNA 是一种新型 RNA原位杂交技术,融合了传统RNA原位杂交技术与FISH技术的优点。基于专利保护的探针组设计方案与专有的信号放大方法,在准确性、灵敏度、重复性等方面都大幅提高,可以在单细胞中对多个目标基因的低拷贝乃至单拷贝RNA做出检测。整个实验流程与FISH相似,但时间大大缩短。

这个划时代的技术使人们对基因研究有了突破性的进展。

(1)这项新技术可应用于以下领域:


·细胞的转录谱分析

·体内外 RNAi 传递和基因敲除

·生物标记物研究

·报告基因筛选

·分子病理学

·干细胞分化

·细胞生物学

·神经生物学

·病原菌检测

·保守基因家族成员检测

·无特异性抗体基因表达检测

(2)相比较传统技术,ViewRNA新技术具有以下优点:



a. 对细胞样本

·悬浮或贴壁的培养细胞,血液细胞组织

·单细胞水平检测单拷贝的RNA

·双“ZZ”探针,特异性高

·同时检测多达4个基因

·极佳的信噪比

·可在载玻片与多孔板上检测

·荧光显微镜检测

·在无法提供特性性抗体的情况下,对免疫细胞化学研究是一种极好的补充

b. 对福尔马林固定,石蜡包埋样本

·FFPE石蜡包埋组织切片

·单基因原位检测

·检测下限可达10拷贝/细胞

·双“ZZ”探针,准确性高

·光学显微镜/荧光显微镜





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