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RNA ISH实验中固定后冰冻切片的样本的制备和预处理

第1 部分:组织切片的制备

A. 固定样本

1. 如果需要,用新鲜制备的含4% 多聚甲醛(PFA)的1×PBS 灌注组织,或直接转到步骤2。

2. 解剖组织并放到新鲜制备的4%PFA 中,4℃ 下固定24 小时。

B. 冷冻组织

1. 4℃下把组织浸入含10% 蔗糖的1×PBS 中,直到组织沉到容器底部(脑组织大约18 小时)。

2. 在含20% 蔗糖的1×PBS 中重复这一步骤,之后是在含30% 蔗糖的1×PBS 中,每次都要等组织沉到容器底部。

3. 在OCT 包埋介质中用干冰或液氮冷冻组织,并将其放在一个密封的容器中储存于-80℃冰箱中。

C. 制备切片

1. 在组织切片前,在低温恒温器中,于-20℃下平衡组织块至少1 小时。

2. 以7-15 μm 厚度切组织块,将切片粘附到SuperFrost. Plus 载玻片(Fisher Scientific # 12-550-15)上。

3. 在-20℃空气干燥载玻片20 分钟,或如果不立即使用载玻片,于-80℃保存载玻片< 3 个月。

4. 载玻片置于Tissue-Tek® 载玻片架上,用200 mL 1×PBS 清洗载玻片5 分钟,上下移动载玻片架去除OCT。

第2 部分:组织预处理

1、加双氧水去除内源性过氧化氢酶,室温(RT)孵 育10分钟。使用足够的溶液完全覆盖切片。用蒸馏 水清洗切片。

2、画阻水圈。

3、加蛋白酶处理。


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