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小鼠脑组织透明处理技术

不同类型的小鼠脑样本适用不同的RapiClear组织透明试剂,具体请参照下表:

样本类型

样本厚度

RapiClear(RC)

透明时间

备注

切片

<500μm

RC 1.47

数小时

-

500-1000μm

RC 1.49

数小时

-

1000μm

RC CS

数周

需与CLARITY配合使用

整脑

RC 1.55

数周

需与ScaleB4   solution一起用

RC CS

数周

抗体染色效果与透膜厚度有关

以≤1000μm厚度为例,小鼠脑切片透明化实验流程

1.       麻醉小鼠,并使用预冷的1×PBS每分钟10mL灌注小鼠,直到流出的PBS无色为止。

2.       用预冷的4%PFA灌流固定。剥离脑组织并将其浸泡在20mL PFA中。

3.       将脑组织置于PFA4℃轻轻振荡过夜。

4.       PBS清洗组织,置于摇床室温20分钟。

5.       脑组织可通过振荡切片机,冰冻切片或组织切片模具手动切片。

6.       将切片置于12孔板中,加入4%PFA,室温处理2小时。

7.       PBS室温洗涤3次。

8.       将样本转移至2%PBST溶液(含2% Triton-X100),室温过夜透化。

9.       可选步骤:免疫染色

9-1. 加封闭缓冲液,置于振荡器或摇床4℃过夜。

9-2. 加入一抗置于摇床,4℃孵育3-5天。

9-3. 室温清洗样本,两次,每次不少于1小时。将样本置于清洗缓冲液(含3% NaCl 0.2% Triton-X 100 PBS4℃摇床过夜

9-4. 加入二抗,置于摇床,4℃孵育1-2天。

9-5. 室温清洗样本两次每次不少于1小时将样本置于清洗缓冲液4℃摇床过夜

10.   可选步骤:DAPI染色

10-1. 加入DAPI4℃摇床过夜。DAPIInvitrogen D3571,制备1mg/ml 储存液)以1:2000稀释后使用

10-2. PBS清洗样本3次,每次20分钟。将样本置于新鲜PBS4℃摇床过夜

11.   用无尘纸吸去样本表面多余的PBS

12.   加入1mLRapiClear 1.47RapiClear 1.49透明试剂(透明试剂可重复使用,不要超过3次),置于摇床,数小时后观察透明程度。37℃预热透明试剂可有助于试剂渗透。样本透明后可进行观察,或置于室温数周不影响成像品质。

13.   iSpacer粘在载玻片或盖玻片上,将样本置于iSpacer孔内,加入新鲜透明试剂,盖上盖玻片。用无尘纸吸去iSpacer周围多余液体。封片。

14.   用共聚焦显微镜或双光子显微镜观察。

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