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构建基因表达慢病毒载体

基因表达慢病毒载体的构建:

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基因表达慢病毒载体由慢病毒基因组序列和细菌质粒序列构成。细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUCori。慢病毒基因组序列是从元件5’LTR开始,到3’LTR结束。

慢病毒基因组序列可容纳两个外源基因表达盒子:一个是目的基因表达盒子,另外一个是marker基因表达盒子。Marker基因表达盒子已经克隆在载体上,无需重新构建。我们提供了荧光marker、抗药性marker或者荧光/抗药性双marker供您选择。目的基因表达盒子则包括两部分序列:启动子和目的基因。每次构建载体,只需通过site-specific recombination cloning技术将感兴趣的启动子和目的基因克隆到载体上即可。

1)克隆方法

我们采用位点特异性重组的克隆方法,将感兴趣的启动子和目的基因克隆到慢病毒骨架上。如下图:

 

一般来说,我们将启动子放在pUp入门克隆上,将目的基因放在pDown入门克隆上。由于我们已建成了一套常用启动子的pUp,因此每次构建时,我们只需构建一个携带目的基因的pDown,再与您选择的启动子和慢病毒骨架载体进行位点特异重组反应则可获得基因表达慢病毒载体。

2)质量控制

我们会对每一个pDown进行目的基因片段测序,序列正确后再进行重组,然后对基因表达慢病毒载体挑克隆,并进行酶切鉴定。酶切鉴定合格后交付。

技术参数


载体功能元件

用途

抗药性基因

功能描述

阳性筛选

Neomycin

真核表达新霉素抗性基因

Puromycin

真核表达嘌呤霉素抗性基因

Hygromycin

真核表达潮霉素抗性基因

Blasticidin

真核表达杀死稻瘟素抗性基因

阴性筛选

coda

作为条件致死显性基因,其产物胞嘧啶脱氢酶能将5-氟胞嘧啶(5-FC)转变成有毒的5-氟尿嘧啶(5-fu),将阻碍胸苷酸的合成,最终影响DNA的合成。

deltaTK

可使无毒性的丙氧鸟苷(GANC)转变为毒性核苷酸而杀死细胞,可用GANC筛选排除随机整合的细胞株。

用途

调控基因

功能描述

可诱导

rtTA(M2)

通过添加四环素或者强力霉素来调控rtTA的产生,从而控制目的基因的表达。

用途

蛋白标记物

功能描述

标记基因

Flag-tag

融合了标签蛋白的目的蛋白,可通过检测标签蛋白来间接确认目的基因是否正常表达,用于细胞染色、免疫印迹、ELISA和免疫沉淀实验中的蛋白标记。

His-tag

Myc-tag


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