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ELISA检测中抗体的选择

  ELISA技术 目录


        在ELISA 实验过程中,抗原和抗体的质量是实验是否成功的关键因素。要求所用抗原纯度高,抗体效价高、亲和力强

一抗:

单克隆或多克隆抗体都可以用作夹心ELISA系统中的捕获和检测抗体。单克隆抗体对单个表位具有固有的特异性,可以对抗原的微小差异进行精细检测和定量。多克隆抗体通常用作捕获抗体,然后,在夹心ELISA检测中将单克隆抗体用作检测抗体,以提供更高的特异性。除了使用传统的单克隆抗体外,重组单克隆抗体也可用于ELISA。例如,兔重组抗体衍生自产生抗体的细胞系,该细胞系经过改造可表达特定的抗体重链和轻链DNA序列。与衍生自杂交瘤的传统单克隆抗体相比,重组抗体不易受细胞系漂移或批次间差异的影响,因此可实现峰值抗原特异性。

选择抗体的另一个设计考虑因素是成本。生产多克隆抗体通常比单克隆抗体便宜(约5倍)。必须权衡通过将单克隆抗体同时用于捕获和检测抗体获得的特异性与生产两种单克隆抗体所需的成本和时间的权衡。另外,准备“自夹心” ELISA分析(使用相同的抗体进行捕获和检测)可能会限制最终ELISA的动态范围和灵敏度。

1)ABfinity重组兔单克隆抗体:

      ABfinity抗体源自可生成兔单克隆抗体的细胞系,并通过分离及克隆特定抗体的重链和轻链 DNA 序列而产生。ABfinity 单克隆抗体产自克隆文库分离出的单一克隆。

优势:

      - 具有兔单抗的高特异性和高灵敏性

      - 重组生产,批次间稳定一致

      - 只结合单个表位的单克隆抗体

      - 无动物源生产

      - 储存 DNA 库而非细胞库

注意事项:

      - 无多表位结合

2)ABfinity重组兔寡克隆抗体:

优势:

      - 具有兔抗体的高特异性和高灵敏性

      - 重组生产,批次间稳定一致

      - 通过DNA文库表达生产的多表位结合位点

      - 无动物源

      - 储存 DNA库 而非细胞库

注意事项:

      - 无单表位结合

      - 由于多表位结合,可能观察到更多交叉反应性

3)噬菌体展示重组单克隆抗体:

      噬菌体展示重组单克隆抗体,经由编码抗体可变区的 DNA 序列跟编码包膜蛋白的噬菌体基因融合后表达。因此,噬菌体包膜在其表面表达抗体融合蛋白。

优势:

      - 重组生产带来的批次间一致性

      - 单表位结合

      - 无动物源生产

      - 储存 DNA库而非细胞库

注意事项:

      - 噬菌体展示抗体相比动物源抗体可能亲和性更低

      - 噬菌体展示抗体缺少糖基化

      - 无多表位结合

4)单克隆抗体:

      单克隆抗体源自杂交瘤细胞。它们的生产包括接种动物(最常用的是小鼠),分离其脾细胞,然后同亲本细胞融合。所得杂交瘤细胞经过表征后筛选最好的克隆用于抗体生产。

优势:

      -单克隆杂交瘤细胞系生产,批次间稳定一致

      - 单表位结合

注意事项:

      - 随着时间推移单克隆抗体会呈现细胞漂移

      - 无多表位结合

      - 需要考虑单克隆抗体的同型特异性

5)兔单克隆抗体:

      兔单克隆抗体源自杂交瘤细胞。它们的生产包括接种兔,分离其脾细胞,然后同亲本细胞融合。所得杂交瘤细胞经过表征后筛选最好的克隆用于抗体生产。

优势:

      - 具有兔全部天然抗体库带来的高特异性

      - 单表位结合

      - 兔中的单个同种型

注意事项:

      - 随着时间推移,兔杂交瘤比小鼠杂交瘤更快呈现细胞漂移(cell-line drift)

      - 无多表位结合

6)多克隆抗体:

      多克隆抗体源自动物免疫产生的 B 细胞。抗体从动物血清纯化,包括结合抗原上不同表位的多种抗体。

优势:

      - 多表位结合

      - 使用全部天然抗体库带来的高特异性

注意事项:

      - 每次动物免疫会造成批次间差异性

      - 无单表位结合

      - 由于多表位结合,更有可能观察到交叉反应性

二抗:


二抗是指用于靶向结合一抗的抗体。在多种免疫印迹、ELISA以及免疫荧光等免疫实验中,二抗经常和一抗结合使用以检测目标蛋白。很多二抗都带有标记物,例如Alexa Fluor荧光染料或辣根过氧化物酶(HRP),从而使二抗的信号可以被检测到。

实验中也可以使用带有标记物的一抗,但是二抗有很多优点。无论是使用哪种一抗进行检测,使用二抗可便于更换不同的标记物。例如,同样的一抗可以与HRP标记二抗一起用于免疫印迹,也可以与另一种Alexa Fluor 488荧光标记二抗一起用于免疫荧光实验。

另外,二抗结合在抗原位置的标记染料比直标一抗要多,从而增强检测信号。使用二抗可以避免对一抗进行复杂且昂贵的化学标记(偶联),而且偶联反应(具有氨基酸特异性)可能干扰一抗对抗原的识别。

选择最佳的二抗要考虑以下因素:

- 种属来源和种属反应性 

- 特异性反应 

- 纯化方法 

- 交叉吸附 

- 多重检测能力 

- 抗体类型和亚型

- 完整抗体还是抗体片段

- 标记物 

- 生物素结合蛋白


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