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人肠类器官的单层上皮培养

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人肠类器官的单层上皮培养(单层人肠上皮培养体系)

肠类器官为研究人员提供了更具生理相关的细胞模型,并被广泛应用于各个研究领域,以提高实验设计的灵活性和精确度。但是,肠类器官的封闭腔室结构不适用于某些特定的实验研究,造成了它的局限性。该操作步骤描述了如何使用建立好的稳定扩增的肠类器官建立单层肠上皮培养体系的方法。单层肠上皮培养体系具有外露的单层上皮的顶面,从而适合多种研究,比如,研究顶端细胞表面受体、与共生或病原微生物的相互作用、模拟肠内容物中潜在的有益或有害物质的作用。单层肠上皮培养体系可培养在玻璃盖玻片上以实现高质量图形成像,也可以培养在Transwell上以检测物质穿过上皮层的主动和被动运输,和电荷屏障功能性检测。单层培养物可以通过不同培养器皿建立,以灵活适应不同培养体系。

在下面操作步骤中,以类器官形态扩增得到的细胞被接种于被稀释的培养基质上,形成均一融合的单层并且在7天内分化形成肠上皮。通过定期换液,可将单层培养物维持培养最多3周。

培养皿的包被


单层肠上皮的培养首先要用稀释的Matrigel溶液对培养皿进行包被。以下步骤适用于使用Coming*Matrigel*进行包被。其它基质液如Collagen I Collagen IⅣ.Vitronectin XF(货号#07180)也可以用于包被(详细步骤请参考产品说明书)。

1. 将分装后的一份Corning Matrigel在冰上解冻。

2.取适量冷的(2.8℃)D-PBS至维形管中并放在冰上。推荐用量请参照表1。

3. 将已解冻的Matrigel"加入到冷的D-PB5里、比例是1 uL的Matrigel*加入49 uLD-PBS。混合均匀.置于冰上。

4. 立助用稀释的好的Matrigee对组织培养处理的培养皿进行包被。包被液体积推荐用量请参考表1.

注意:保证包被液均匀覆盖培养皿度部;包被液不足会导致细胞无法贴壁。

5. 在使用前至少在37℃孵育1小时。避免使Matrigel溶液挥发。

注意:如果不立即用、用封口膜密封培养以防止Matrigel溶液挥发,可在2-8℃存放最多1周。继续下一步骤前应将之前储存的Matrigel溶液在室温复温30分钟。

6. 慢慢倾斜培养皿使多余的MatrigelP溶液聚集到边缘。吸取出多余的Matigel溶液、注意不要刮到包被表面。

表1  建议添加的稀释的Matrigel体积

培养皿每孔使用稀释的Matrigel的体积(µL)
6孔板1000
24孔Transwell培养板200
24孔板100
96孔板200

准备培养基


下例为制备100 mL的单层生长培养基(IntestiCult™ 类器官培养基组分 A +组分B + Y-27632)。如需准备不同体积,可根据以上比例调整。

1. 在室温(15 - 25℃)或在2 - 8℃过夜解冻IntestiCult™ 类器官培养基组分 A和组分 B。

注意:解冻后立即使用,或分装储存在-20℃,最多可保存三个月。分装的样本解冻后立即使用,不可反复冻融。

2. 将50 mL的组分B加入50 mL的组分 A。混合均匀。

3. 加入10 μM的Y-27632。混合均匀。

注意:如果不立即使用,可在2 - 8℃保存最多1周。

4. 使用前加入抗生素(如,50 μg/mL庆大霉素)。

将肠类器官接种为单层培养体系


1. 按照以下描述收集3-4个类器官的Matrigel®domes(约含100-150个类器官)。使用不同培养皿时建议收集的dome数量请参考表2。

2. 向每个含有dome的孔中加入1mL的温和细胞解离试剂(GCDR,货号#07174)。

3. 室温(15-25℃)孵育1分钟。

4. 使用1000μL的移液枪头,用力吹打以吹散Matrigel®dome结构并重悬类器官。

表2 将肠类器官接种为单层培养体系时建议收集的dome数量

待接种的培养皿每孔接种所需dome数量*
24孔板3-4
24孔Transwell培养板2-3
96孔板1

*假设收集50 μL大小的domes。

注意:接种效率根据类器官传代次数而变化。

5. 将悬液在室温孵育10分钟,同时轻柔的搅动或震荡。

6. 将几个孔的悬液混合。200xg,2-8℃,离心5分钟。

7. 弃去上清液。加入3mL冷的DMEM/F-12。200xg,2-8℃,离心5分钟。

8. 吸出尽量多的上清液,尽量不要打扰到底部沉淀。将类器官重悬于1mL预热的(37℃)Trypsin-EDTA(0.05%)中。

9. 用1000μL的移液枪头将悬液吹打混匀。将类器官在37℃孵育5-10分钟。

10. 用力吹打或涡旋以尽量混匀并破坏类器官。将类器官放在显微镜下观察以确认其结构被破坏。类器官应该被分散成单个细胞或小的类器官片段(fragment)。如果有大量大的fragment或整个类器官存在,应重复吹打或涡旋步骤以保证碎片被分散(图3)。

注意:以下的步骤需尽快完成,因为细胞容易发生聚集。


Fig3.jpg

图3. 以单层接种前,类器官必须被打散成单细胞或小细胞团

A. 单细胞是单层接种最理想的选择。

B. 小的细胞团也可以用于单层接种。

C.大的细胞团不适合进行单层接种。如果吹打后仍存

在大的细胞团,建议进行重复吹打和涡旋(第10步)以获得小

的细胞团或单个细胞。


11.加入1mLDMEM/F-12后吹打混匀。将碎片以200xg,2-8℃,离心5分钟。

12.弃去上清液并将类器官碎片重悬于单层生长培养基中,详情参考表3。

表3 重悬类器官所需单层生长培养基体积

待接种的培养器皿每孔接种需要的单层生长培养基体积
6孔板1.5 mL
24孔Transwell培养板500 µL
24孔板≥100 µL 
96孔板100 µL

13.缓慢轻柔地将细胞悬液加入孔中。在37℃和5% CO2培养。每天观察成长情况。每隔2-3天进行培养基完全换液。

注意:单层一般在2-3天达到100%汇合率(满板程度);若贴壁效果不好,则扩增速度会减缓。但给予足够的培养时间后,汇合率仍然会达到100%。

友情提示:培养开始后,如果保证按时换液,细胞活力和单层的融合率可维持至少3周。如果需要进行特定实验,可以用DMEM/F-12替换单层生长培养基。单层可在DMEM/F-12中维持细胞活力和完整性至少24小时。单层可在Intestinal类器官分化培养基维持至少1周以进行进一步分化。

Fig4.jpg

图4. 在24孔Transwell培养板中培养的肠上皮单层体系(Intestinal 单层培养

随着培养进行,单层会达到100%融合率。此过程一般需要2-3天,但

其会受接种效率影响,而接种效率可能会受到类器官传代次数影响。

A. 低融合率的人单层肠类器官(小于25%)

B. 接种2天后的人单层肠类器官(50%的融合率)

C. 培养7天后的人单层肠类器官(100%的融合率)

Fig5.jpg

图5. 培养7天后的IntestinalMonolayer将IntestinalMonolayer培

养于玻璃盖玻片(置于培养孔中)上,并使用荧光染色成像。

A. 使用E-cadherin(红色)、Villin(绿色),和DAP(I蓝色)进行染色。

B. Cytokeratin18(绿色)和Tricellulin(红色)表明单层内存在三细胞紧

密连接(tricellulartightjunctions)。细胞核使用DAP(I蓝色)进行复染。


主要试剂和材料


货号名称
06010IntestiCult类器官培养基
IntestiCult类器官培养基组分A(#06011)
IntestiCult类器官培养基组分B(#06012)
36254含15mM HEPES DMEM/F12 培养基
37350不含钙和镁的D-PBS
07174GCDR细胞解离试剂
38017经组织处理过的24孔培养板
72302Y-27632 (2HCl), 1 mg
356231Corning® Matrigel
35235070 µm细胞筛

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